Penentuan Kandungan Asid Oksalik dalam Buah-buahan dan Sayur-sayuran melalui Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi (HPLC)

Penentuan Asid Oksalik Kandungan dalam Buah-buahan dan Sayur-sayuran melalui Kromatografi Cecair Berprestasi Tinggi (HPLC)
1. Reka Bentuk Prinsip dan Kaedah Eksperimen
Sebagai asid organik biasa dalam buah-buahan dan sayur-sayuran, kandungan asid oksalik secara langsung mempengaruhi rasa dan nilai pemakanan makanan. Eksperimen ini menggunakan kromatografi cecair berprestasi tinggi fasa terbalik (RP-HPLC). Di bawah keadaan fasa bergerak berasid, asid oksalik diasingkan berdasarkan garis dasar daripada bahan yang mengganggu menggunakan lajur kromatografi C18. Pengesan ultraungu yang ditetapkan pada 210 nm digunakan untuk analisis kuantitatif, berdasarkan ciri penyerapan UV kumpulan karboksil dalam molekul asid oksalik.
2. Lengkung Piawai dan Penyediaan Sampel
Kaedah pencairan kecerunan digunakan untuk menyediakan larutan piawai: timbang 25.0 mg asid oksalik dihidrat dengan tepat dan cairkan kepada 25 mL dengan air ultratulen untuk mendapatkan larutan stok 1 mg/mL. Ini dicairkan secara berurutan ke dalam satu siri larutan piawai pada 50, 100, 200, 400, dan 800 µg/mL, dengan setiap kepekatan disuntik dalam tiga kali ganda.
Untuk penyediaan sampel, pengekstrakan berbantukan gelombang mikro digunakan: timbang 5.00 g homogenat buah-buahan/sayur-sayuran, tambahkan 10 mL larutan asid hidroklorik 0.1 mol/L, panaskan pada suhu 60°C dengan gelombang mikro selama 10 minit, tapis melalui penapis membran 0.45 µm, dan kumpulkan filtrat untuk ujian.
3. Pengoptimuman Keadaan Kromatografi
Fasa bergerak ialah sistem penimbal kalium dihidrogen fosfat (pH 2.5)–asetonitril (95:5) 0.01 mol/L, dengan kadar aliran 0.8 mL/min dan suhu lajur 35°C. Pelarasan perkadaran asetonitril menunjukkan bahawa apabila fasa organik melebihi 10%, masa pengekalan asid oksalik menjadi lebih pendek kepada kurang daripada 3 minit, tetapi puncak tailing berlaku. Di bawah keadaan optimum akhir, masa pengekalan asid oksalik ialah 4.2 minit, mencapai pemisahan lengkap daripada asid sitrik dan asid malik bersebelahan (resolusi > 1.5).
4. Pengesahan Kaedah
Pengesahan julat linear menunjukkan hubungan linear yang baik antara luas puncak dan kepekatan dalam julat 10–1000 µg/mL (R² = 0.9993). Had pengesanan (LOD), yang ditentukan oleh kaedah nisbah isyarat-ke-hingar, ialah 0.5 µg/mL. Dalam ujian kebolehulangan, RSD untuk enam penentuan replika sampel bayam yang sama ialah 1.8%. Eksperimen pemulihan lonjakan pada tiga tahap (80%, 100%, dan 120%) menghasilkan purata pemulihan masing-masing sebanyak 98.2%, 102.4%, dan 97.8%, memenuhi keperluan untuk analisis kuantitatif.
5. Analisis Sampel Sebenar
Enam buah-buahan dan sayur-sayuran yang tersedia secara komersial telah diuji: bayam (356 ± 12 mg/100 g), saderi (215 ± 9 mg/100 g), tomato (18 ± 2 mg/100 g), epal (6 ± 1 mg/100 g), pisang (tidak dikesan), dan brokoli (89 ± 5 mg/100 g). Perbandingan dengan kaedah standard kebangsaan (GB 5009.277-2016) menunjukkan bahawa sisihan relatif antara kedua-dua kaedah adalah kurang daripada 5%, mengesahkan kebolehpercayaan kaedah ini. Khususnya, kaedah HPLC mempamerkan kepekaan yang lebih tinggi daripada kaedah titrasi tradisional apabila menganalisis sampel kandungan rendah.
6. Nota Utama
Kawal nilai pH dengan ketat semasa prarawatan sampel. Jika pH ekstrak melebihi 3, pemendakan kalsium oksalat akan menyebabkan keputusan ujian yang rendah. Fasa bergerak perlu disediakan segar setiap hari untuk mengelakkan pemendakan garam dan penyumbatan lajur. Selepas setiap 20 suntikan, siram lajur dengan asetonitril-air (30:70) selama 30 minit untuk mencegah degradasi kecekapan lajur. Untuk sampel yang mengandungi pigmen (contohnya, kubis ungu), adalah disyorkan untuk menambah langkah penulenan pengekstrakan fasa pepejal sebelum suntikan.
7. Arahan Aplikasi dan Pengembangan
Kaedah ini boleh diperluaskan kepada pengesanan asid oksalik dalam sampel biologi seperti air kencing dan darah. Dengan melaraskan komposisi fasa bergerak (contohnya, menambah tetrabutilamonium hidroksida), asid oksalik dan metabolitnya boleh ditentukan secara serentak. Digabungkan dengan pengesan spektrometri jisim, kaedah pengesanan jejak yang lebih tepat boleh diwujudkan. Dalam industri pemprosesan makanan, kaedah ini boleh menyediakan sokongan data penting untuk pemilihan varieti asid oksalik rendah dan pengoptimuman proses memasak.